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綿羊痘(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LDSV)核酸檢測試劑

（熒光PCR法，外源內(nèi)標(biāo)）

包裝規(guī)格：48 T/盒

產(chǎn)品說明：

采用Taqman探針技術(shù)，以羊痘病毒屬(GaPV)中綿羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LDSV)的特異性保守基因為靶位點設(shè)計特異性引物和探針，用于樣品中SPPV、GTPV和LDSV核酸的輔助檢測。本產(chǎn)品引入了dUTP / UDG 系統(tǒng)，可降解含U的ssDNA和dsDNA，消除由PCR產(chǎn)物導(dǎo)致的交叉污染。 同時設(shè)置陽性內(nèi)對照 (即內(nèi)標(biāo)，使用VIC報告基團)，通過檢測內(nèi)標(biāo)是否正常來監(jiān)測qPCR體系中是否含有 PCR抑制物，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

產(chǎn)品組成：

注：不同批號產(chǎn)品的成分之間不可以混用或互換！！！

儲存條件和保質(zhì)期：

在-20±5℃避光儲存，有效期12月。干冰運輸。重復(fù)凍融小于5次。生產(chǎn)日期，失效日期請見外包裝盒。

適用儀器：

ABI7500、宏石96P、Bio-Rad CFX96實時熒光PCR儀等。

樣品要求：

1、適用樣品類型

活體或剖檢牛羊的皮膚丘疹、肺部病變組織、淋巴結(jié)、血液等樣品。

要求送檢新鮮樣品，禁止反復(fù)凍融！

2、樣品處理（核酸提取區(qū)）

參照《NY/T 541-2016 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范》等標(biāo)準(zhǔn)進行樣品前處理， 使用商業(yè)化的提取試劑盒提取樣品中的核酸。提取時，每200 μL陰性對照和處理后的樣品溶液中添加10 μL內(nèi)標(biāo)對照，提取后的核酸應(yīng)立即檢測，否則凍存于-20±5℃，保存時間不超過6個月，禁止反復(fù)凍融！

*內(nèi)標(biāo)對照的其它使用方法：將內(nèi)標(biāo)對照混入 qPCR工作液中，但僅僅質(zhì)控擴增過程和監(jiān)測qPCR體系中是否含有 PCR抑制物，不能質(zhì)控提取核酸過程。

檢測方法

為了防止污染，實驗需分區(qū)操作！！！

注：核酸提取參照樣品要求，在核酸提取區(qū)進行或在樣品處理區(qū)進行。

1、試劑準(zhǔn)備 (在試劑準(zhǔn)備區(qū)進行)

(1) 推薦方式（內(nèi)標(biāo)對照質(zhì)控核酸提取和核酸擴增過程）

取出試劑盒中的各組分以及自備試劑，室溫放置，待溫度平衡至室溫，混勻后備用；

根據(jù)檢測樣品數(shù)量，建議每次檢測均設(shè)置陰性對照和陽性對照。將所需數(shù)量（N）的GaPV PreMix-2分配到每個微離心管（如八連管）中，20 μL/管。待檢樣品數(shù)為n時，所需反應(yīng)數(shù)N=樣品數(shù)(n)+陽性對照(1)+陰性對照(1)；

當(dāng)準(zhǔn)備使用時，再轉(zhuǎn)移到樣品處理區(qū)。

(2) 其它方式（內(nèi)標(biāo)對照僅質(zhì)控核酸擴增過程）

根據(jù)所檢測的樣品數(shù)量按照下表配制反應(yīng)液，建議每次檢測均設(shè)置陰性對照和陽性對照。待檢樣品數(shù)為n時， 需配制反應(yīng)體系數(shù)N=待檢樣品數(shù)(n) +陽性對照(1)+陰性對照(1)+1。

*qPCR工作液配制表（其它方式）

*注：本配制方法為在提取樣品核酸未加內(nèi)標(biāo)對照時的補救方法，不推薦。

將配制好的qPCR工作液充分混勻后瞬時離心，待用；當(dāng)準(zhǔn)備使用時，將等量的20 μL分配到每個微離心管（如八連管）中，并轉(zhuǎn)移到樣品處理區(qū)。

2、樣品加樣 (在樣品處理區(qū)進行)

 在每個PCR管中加入5 μL經(jīng)提取的待測樣品和陰性對照、陽性對照，蓋上管蓋， 瞬時離心，使液體全部沉于管底。

3、qPCR擴增 (在擴增與分析區(qū)進行)

 (1) 熒光通道選擇

熒光基團選擇FAM通道檢測GaPV；選擇VIC 通道檢測內(nèi)標(biāo)；淬滅基團設(shè)置為none。如ABI qPCR儀，還需設(shè)置Passive Reference為none。其它儀器參考儀器說明書。

(2) qPCR擴增程序設(shè)置

設(shè)置反應(yīng)體系為25 μL。

4、結(jié)果分析 (以ABI7500 qPCR儀為例)

反應(yīng)結(jié)束后，qPCR儀將自動生成結(jié)果。若儀器自動生成的擴增曲線或閾值線有異常，用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，基線Start值可以在 3~10，基線End值可設(shè)在 5~20，調(diào)整各擴增曲線的基線區(qū)相對水平即可。點擊Analyze 進行分析。

5、質(zhì)量控制

試劑盒中各控制項應(yīng)符合下列要求，否則實驗無效。

參考qPCR工作液配制表（其它方式）配制時，陽性對照的VIC通道應(yīng)均出現(xiàn)S型曲線，Ct值≦35。

檢驗結(jié)果的解釋

（1）若樣品的VIC通道呈典型的S形曲線且Ct≦35時，

A. 當(dāng)FAM通道Ct≦35，判定為GaPV陽性；

B. 當(dāng)FAM通道Ct值在35到40之間時，需要觀察靶基因的擴增曲線是否呈S形，如果曲線呈S形，樣品應(yīng)視為疑似GaPV陽性，需重新檢測；復(fù)測結(jié)果若Ct值≦40且具有典型S形曲線，判定為GaPV陽性；反之若為無Ct顯示、Ct>40或無典型S形曲線，則判定為GaPV陰性。

C. 當(dāng)FAM通道Ct>40，判定為GaPV陰性。

（2）如果VIC通道的Ct值高于35，而沒有顯示明顯的S形擴增曲線，原因如下：

1) 樣品中存在PCR抑制劑，建議實驗前稀釋模板。

2) 核酸提取操作存在缺陷，建議重復(fù)核酸提取進行檢測。

3) 在處理過程中沒有獲得合格的樣品，或者在運輸和儲存過程中樣品已經(jīng)降解，建議重新采樣。

檢驗方法的局限性

1) 陰性結(jié)果可能是由于從樣品中提取的核酸質(zhì)量低，儲存條件不當(dāng)，儲存期不合適，樣品中存在抑制劑，核酸降解和核酸提取方法的提取效率差等原因。

2) 不合理的樣品采集、運送與保存條件，樣品中病毒含量過低，或不合理的實驗操作和環(huán)境很可能造成假陰性或假陽性結(jié)果。其它臨床觀察和相關(guān)資料應(yīng)結(jié)合測定，必要時再次進行檢測。

3) 由于突變或其它原因，靶序列的序列變化可能會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

注意事項：

1) 本產(chǎn)品僅用于科研使用，使用前請仔細(xì)閱讀本說明書。

2) 實驗前請熟悉和掌握需使用的各種儀器的操作方法和注意事項，對每次實驗進行質(zhì)量控制。

3) 實驗室管理需嚴(yán)格遵照PCR基因擴增實驗室的管理規(guī)范，實驗人員必須進行專業(yè)培訓(xùn)，實驗過程嚴(yán)格分區(qū)進行， 所有消耗品僅作一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不可交叉使用。

4) 所有檢測樣品均視為具有傳染性的物質(zhì)，實驗過程中穿工作服并經(jīng)常更換手套，以避免樣品間的交叉污染；

5) 樣品操作、廢棄物處理應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)要求：《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理 條例》。

6) 所有試劑 (包括本產(chǎn)品中的組分與客戶自備試劑) 使用前均需徹底化凍、混勻。

7) 血液類樣品溶血嚴(yán)重時，會使擴增曲線高度顯著下降。因此，當(dāng)使用該試劑盒同時檢測血液樣品原液和生理鹽水稀釋 樣品時，建議對2類模板分別設(shè)置不同的閾值線，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

8) 當(dāng)出現(xiàn)多個樣品的Ct值>40時，可能是qPCR儀自動生成的閾值線較高的原因，建議將閾值線高度設(shè)置在擴增曲線 最大熒光值的1/15左右后，重新分析。

本產(chǎn)品僅供科研使用，檢測結(jié)果不能用作臨床診斷判斷唯一依據(jù)

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