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呋喃唑酮代謝物快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物呋喃唑酮代謝物將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物呋喃唑酮代謝物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物呋喃唑酮代謝物的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   0.01ppb

u 孵育溫度：       25℃

u 孵育時間：       30min~15min

u 樣本檢測下限

肌肉組織   ·································   0.05ppb

雞蛋    ·······································  0.05ppb

蜂蜜   ·········································  0.05ppb 

u 交叉反應率

呋喃唑酮代謝物 ·································  100%

呋喃它酮代謝物 ·······························  ＜0.1%

呋喃妥因代謝物 ·······························  ＜0.1%

呋喃西林代謝物 ·······························  ＜0.1%

u 樣本回收率

肌肉組織   ·································  95%±25%

雞蛋    ······································  95%±25%

蜂蜜   ·······································  85%±23%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋

微量移液器：單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl

試      劑：*、K₂HPO₄·3H₂O、正己烷、乙酸乙酯、濃HCl

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

u 樣本前處理需配制

配液1  0.1M K₂HPO₄溶液：

稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O加去離子水溶解定溶至500ml。

配液2  1M HCl 溶液：

取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。

配液3  1M NaOH溶液：

稱4g NaOH加去離子水定容至100ml

配液4  樣本復溶液：

將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。

u 樣本處理

（a）肌肉、雞蛋樣本處理方法

稱取1±0.05g的均質物，分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑，充分振蕩2min；

在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；

分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯，充分振蕩30s；

在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現乳化現象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復離心；或提高轉速和延長離心時間重復離心）；

取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干。

用2ml正己烷溶解干燥物，再加入1ml樣本復溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現乳化現象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復離心）；

取50µl下層用于分析。

樣本稀釋倍數:  2倍

（b）蜂蜜樣本處理方法

稱取2±0.05g的均質物（蜂蜜），分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑，充分振蕩2min；

在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；

分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯，充分振蕩30s；

在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現乳化現象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復離心；或提高轉速和延長離心時間重復離心）；

取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干；

用2ml正己烷溶解干燥物，再加入1ml樣本復溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現乳化現象，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復離心）；

取50µl下層用于分析。

樣本稀釋倍數:  1倍

六、 酶標免疫分析程序:

u 測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標準品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環境中反應30min。

6、 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。

8、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃唑酮代謝物量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.01ppb為1.816；0.03ppb為1.415；0.09ppb為0.74；0.27ppb為0.313；0.81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.27ppb～0.81ppb；樣本2的濃度范圍是0.03ppb～0.09ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃唑酮代謝物實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃唑酮代謝物標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃唑酮代謝物實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲藏條件和保質期

1、 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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